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蓝白斑筛选

来源:海南琼海 发布时间:2020-04-18 09:21|浏览量:

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  野生型埃希氏大肠菌(i)发作的β-半乳糖苷酶可能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使全数菌落发作蓝色转移。正在经人工插入外源基因后,突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因堵截,无法变成完好的β半乳糖苷酶,故不行对无色化合物X-gal举行切割,菌落呈白色。

  蓝白斑筛选是重组子筛选的一种步骤,是遵循载体的遗传特点筛选重组子,要紧为α-互补

  极少载体(如PUC系列质粒)带有β-半乳糖苷酶(lacZ)N端α片断的编码区,该编码区中含有众克隆位点(MCS),可用于构修重组子

  策画实用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变,酿成其编码的β-半乳糖苷酶遗失平常N端一个146个氨基酸短肽(即α肽链),从而不具有生物活性,即无法影响于X-gal发作蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因,lacz中征求:一段β-半乳糖苷酶的启动子;编码α肽链的区段;一个众克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中,是外源DNA的挑选性插入位点。固然上述缺陷株基因组无法稀少编码有活性的β-半乳糖苷酶,但当菌体中含有带lacz的质粒后,质粒lacz基因编码的α肽链和菌株基因组外达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补,具有与完好β-半乳糖苷酶肖似的影响X-gal天生蓝色物质的才力,这种景色即α-互补。

  操作中,增加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz中的β-半乳糖苷酶的启动子,正在含有X-gal的固体平板教育基菌落显现蓝色。以上是领导空载体的菌株发作的外型。当外源DNA(即方针片断)与含lacz的载体毗邻时,会插入进MCS(位于LacZ中的众克隆位点),使α肽链读码框毁坏,这种重组质粒不再外达α肽链,将它导入宿主缺陷菌株则无α互补影响,不产存在性β-半乳糖苷酶,即不行解析教育基中的X-gal发作蓝色,教育外型即显现白色菌落。

  实习中,一般蓝白筛选是与抗性筛选一同利用的。含X-gal的平板教育基中同时含有一种或众种载体所领导抗性相对应的抗生素,如此,一次筛选可能剖断出:未转化的菌不具有抗性,不发展;转化了空载体,即未重组质粒的菌,长成蓝色菌落;转化了重组质粒的菌,即方针重组菌,长成白色菌落。

  周玉亭, 曹修斌. α-互补与蓝白斑筛选机制的探究[J]. 生物工夫传递, 2010(8):218-221.

  潘韵芝. 蓝白斑筛选工夫的改善及其生物医学使用[D]. 姑苏大学, 2014.

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